GeneBrick ® Cell Counting Kit

0GeneBrick®  Cell Counting  Kit（CCK-8） CCK-8 检测试剂盒

GeneBrick®Cell Counting Kit（CCK-8 ） 是一种基于  WST-8（化 学名： 2-(2- 甲氧 基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基 )-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐） 的0广泛应用于细胞增殖和细胞毒性 的快速高灵敏度检测试剂盒。

CCK-8 溶液可以直接加入到细胞样品中， 不需要预配各种成分， 酚红和血清对检测不会 造成干扰。WST-8 在电子耦合试剂 存在的情况下， 可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物 formazan。颜色的深浅与细胞的增殖成正 比，与细胞毒性成反比。

WST-8 对细胞无明显毒性。加入 CCK-8 溶液显色后， 可以在不同时间反复用酶标仪读板， 检测时间更加灵活， 便于确定最佳 测定时间。本试剂盒尤其适用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因 子的活性检测等，可以用于 细胞因子等诱导的细胞增殖检测，也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测， 或一些药物诱导的细胞生长抑制 检测。

产品特色：

比 MTT，MTS 或 WST-1 更敏感， 数据可靠重复性好

无需放射性同位素和有机溶剂，对细胞毒性低

即开即用，操作更简单，无需有机溶剂，省时省力

稳定性高，2-8℃避光保存效期长达 3 年

Order Information 订货信息：

存储条件：

-20 °C 干燥避光冻存，有效期长达五年。 2-8 °C 干燥避光保存，有效期至少三年。

反复冻融会导致背景增加，干扰您的检测。如果频繁使用，请将试剂盒存放在 2-8 °C。

操作步骤：

1. 制作标准曲线

a. 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量， 然后接种细胞；

b. 按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度， 一般要做  5-7 个细胞浓度梯度， 每组4-6 个复孔；

c. 接种后培养 2-4 小时使细胞贴壁， 然后每 100   μL 培养基加  10   μL CCK-8 试剂培养一定 时间后测定 OD 值， 制作出 一条以细胞数量为横坐标， OD 值为纵坐标的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量。使用此标准曲线的前 提条件是试验条件完全一致。

2. 细胞活性检测

a. 在 96 孔板中接种细胞悬液 (100  μL/孔) ， 将培养板放在培养箱中预培养 24 小时；

b.  向每孔加入 10   μL  的  CCK-8 溶液  (注意不要产生气泡) ；

c. 将培养板置于培养箱内孵育 1-4 小时；

d. 用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。

3. 细胞增殖-毒性检测

a. 在 96 孔板中接种细胞悬液 (100  μL/孔) ， 将培养板放在培养箱中预培养 24 小时；

b.  向培养板加入不同浓度的待测药物；

c. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间；

d.  向每孔加入 10   μL  的  CCK-8 溶液  (注意不要产生气泡)；

e. 将培养板置于培养箱内孵育 1-4 小时； f. 用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。

4. 计算公式

细胞存活率=[(As-Ab) / (Ac-Ab)]  ×  100%

抑制率=[(Ac-As) / (Ac-Ab)]  ×  100%

As: 实验孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液和药物溶液)  Ac: 对照孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液， 不含药物) Ab: 空白孔吸光度 (含培养基、CCK-8 溶液， 不含细胞、药物)

注意： 如果待测物质有氧化性或还原性的话， 可在加 CCK-8 之前更换新鲜培养基（除去培养  基， 并用培养基洗涤细胞两次 , 然后加入新的培养基）， 去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下， 可以不更换培养基， 直接扣除培养基中加入药物后 的空白吸收即可。

注意事项及重要提醒：

1. CCK-8 的培养时间一般为 1-4 小时， 但在培养 30 分钟左右即可取出肉眼观察显色程度，根据细胞种类而定， 需要摸索条 件， CCK-8 的最佳反应时间以具体显色的最佳时间为准。

注意： 白细胞可能需要培养较长时间。

2. 使用  96 孔板进行检测时，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发问题。一方面，由于 96  孔板周围一圈最容易蒸发，可 以采取弃用周围一圈的办法，改加相同量的  PBS 、水或培养液；

另一方面， 可以把 96 孔板置于靠近培养箱内水源的地方， 以缓解蒸发。

3. 本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应， 所以还原剂 (例如一些抗氧化剂) 会干扰检测 ， 如果待检测体系中存在较多的

还原剂，需设法去除。用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡， 否则会干扰测定。

4. 加入药物中如含有金属， 对 CCK-8 显色有影响。终浓度为 1 mM 的氯化亚铅、氯化铁、 硫酸铜会抑制  5%  、15%  、90% 的 显色反应， 使灵敏度降低。如果终浓度是 10 mM  的话，将会 100% 抑制。

5. 培养基中的酚红不会影响实验结果， 酚红的吸光度可以在计算时， 通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去， 因此不会对检 测造成影响。

6. 本产品可以检测 E.coli ， 但不能检测酵母细胞 。向  100 μL E.coli  培养液  中加入  10 μ lCCK-8 溶液， 并培养 1-4 小时或过夜。

7. CCK-8  试剂对细胞的毒性非常低。它和活细胞内的脱氢酶持续反应使溶液颜色不断加深，OD 值不断增加 (注: 活细胞内的脱 氢酶是持续产生的) 。要测定细胞的具体数量， 建议同时做标准曲线。

8. 建议采用多通道移液器， 以减小平行孔间的差异。 以下方法可以终止 CCK-8 反应 (96 孔板) ：

1. 本产品仅限于专业人员的科学研究用， 不得用于临床诊断或治疗， 不得用于食品或药品。

2. 为了您的安全和健康， 请穿实验服并戴一次性手套操作。

常见问题解答  (FAQs)

1） Q： 每个孔需要接种的细胞数量是多少？

A： 对于贴壁细胞， 每孔至少需要 1000 个细胞（100  μL 培养基） 。对于白细胞， 由于灵敏度较低，每孔至少需要 2500 个 细胞（100  μL 培养基）。推荐的 96 孔板每孔最大细胞数为 25000。如果使用 24 孔或 6 孔板进行该检测， 请计算相应的每 孔的细胞数， 并调整 CCK-8 的体积， 使其为每孔总液体体积的 10%。

2） Q： CCK-8 对细胞的毒性大小如何？

A： CCK-8 的毒性非常低， 在 CCK-8 测定完成后， 相同的细胞可用于其他细胞增殖测定， 例如结晶紫测定， 中性红测定或 DNA

荧光测定。（除非细胞极为稀少， 不推荐把 CCK-8 测定过的细胞用于其它实验。

3） Q： 怎么设置空白对照？

A：在不含有细胞的培养基中加入 CCK-8，酶标仪检测 450 nm 的吸光度；若做药物刺激实验，可在不含细胞、含药物的培养基中 加入 CCK-8。酶标仪检测 450 nm 的吸光度作为空白对照。

4） Q： CCK-8 能否用于细胞染色？

A： CCK-8 不能用于细胞染色， CCK-8 检测原理是高水溶性的四唑盐 WST-8 在电子耦合试剂存在下还原产生水溶性formazan 形 式的染料， WST-8 及 formazan 是高度水溶性的， 不会进入细胞内对细胞进行染色。

5） Q： 没有 450 nm 的滤光片， 能否使用其他滤光片？

A：如果您没有 450 nm滤光片。您也可以使用吸光度在 430 nm 和 490 nm之间的滤光片, 450nm 滤光片具有最佳灵敏度。

6） Q： 哪些物质会干扰 CCK-8 的测定？

A： WST-8 可能与还原剂反应生成 WST-8 formazan， 如果使用还原剂（例如一些抗氧化剂）会增加 OD 值； 若存在氧化性物质 则会抑制 CCK-8 测定反应， 减小 OD 值； 此外， 培养基中的酚红不会影响实验结果，酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除 空白孔中本底的吸光度而消去。

7） Q： 在做药物刺激实验时， 药物对测定是否有影响？

A： 如果药物有还原性， 则会与 CCK-8 发生反应， 影响吸光度； 药物中金属离子的存在可能会影响 CCK-8 的灵敏度。终浓度 为 1 mM  的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制 5%  、15%  、90%的显色反应， 使灵敏度降低。如果终浓度是 10 mM 的话， 将 会 100%抑制。

8） Q： 如果吸光度值太低， 可以采取什么办法？

A： 适当增加细胞数量或延长加入 CCK-8 溶液后的孵育时间。

9） Q： 如果吸光度值太高， 可以采取什么办法？

A：适当减少细胞数量（建议正式实验前优化细胞数量与荧光值之间的关系）或缩短加入 CCK-8溶液后的孵育时间。