蛋白质 SDS-PAGE Tris-Tricine 电泳系统标准操作规程
蛋白质 SDS-PAGE Tris-Tricine 电泳系统 标准操作规程
方案参考： Schägger, H. Tricine –SDS-PAGE. Nat Protoc 1, 16 –22 (2006)
*有修改 ，具体原理及方法来源详参本方案末尾所附参考文献
实验器材和试剂：
垂直电泳系统（电源、电泳槽等一系列配套设施），制胶用玻璃板（厚板 1mm spacer plate 和 薄 板 short plate）及塑料框架 ，微量移液器和配套吸头（ 1mL、 200μL、 10μL） ，离心管（ 1.5mL、 15mL、 50mL）， 烧杯 ，容量瓶（ 100mL） ，量筒（ 100mL、500mL、 1000mL） ，广口试剂瓶（ 500mL、 1000mL） ，棕色瓶 （ 250mL、 500mL） ，滤纸 ，无尘擦拭纸 ，保鲜膜/密封袋 ，玻璃棒 ， pH 计等。
**制胶及电泳设备多个厂家均有生产销售 ，建议选用同一制造商的配套设备 ，如 Bio-rad Mini-PROTEAN® system、Tanon® VE-180 system 等 ，并按照制造商提供的操作手册组装使用。试剂瓶应选择带刻度 ，且较 为准确的产品。
试剂准备（见附录）
• 乙二醇（电泳级）
• 40% 丙烯酰胺: N,N’ -亚甲基双丙烯酰胺（ 29:1） (40% Acr-Bis)浓缩胶
• 40% 丙烯酰胺: N,N’ -亚甲基双丙烯酰胺（ 19:1） (40% Acr-Bis)分离胶
• 10% APS
• TEMED
• 4 ×多肽电泳凝胶缓冲液（ 3M Tris-HCl ; 0.4% SDS, pH 8.45）
• 10 ×Tris-tricine-SDS 电泳缓冲液 (使用之前稀释到 1 ×浓度)
聚丙烯酰胺凝胶的配制（18%T, 5%C/6mL 分离胶; 5%T,3.3%C/4mL 浓缩胶）：
> 凝胶模具准备
根据实验需求选择不同厚度电泳玻璃片,建议选用较薄的玻璃板，有利于小分子蛋白电泳 观
察、转膜（如 1mm ，0.75mm 玻璃板）。
用 75%酒精擦拭玻璃片 ，再用蒸馏水冲洗 ，用无尘擦拭纸擦净玻璃。 将玻璃板按照相应使用说明固定在灌胶器上。
> 配制分离胶
按表 1 将不同体积成分均匀混合，可使用 1mL 移液器沿着玻璃板壁将分离胶溶液缓缓注 入模具 ，凝
胶液加至约距前玻璃板顶端 1.5 cm 或距梳齿约 0.5 cm 即可。
配制浓缩胶 ，按表 2 将不同体积成分均匀混合将溶液沿玻璃板壁缓缓注入模具 ，达到 玻璃板
顶端时停止 ，轻轻把梳子垂直插入浓缩胶 ，静置 30~60 min。
待胶凝固后 ，连带玻璃板一起将放入电泳槽 ，加入电泳缓冲液后再小心拔出梳子 ，准备 上样
电泳。或置于自封袋中密封保存于 4℃（袋中可加入少许蒸馏水保持水分）。
蛋白电泳
> 样品准备
提前打开水浴锅或金属浴 ，温度一般设置为 70~100℃ ;
将适量蛋白样品转移至 1.5mL 离心管中 ，注意排序编号并记录； 按比例加入上样缓冲液；
把样品置于水浴锅中加热 10~15 分钟；
取出样品冷却至室温 ，瞬时离心 10~30s； 按编号排序 ，准备上样。
*根据需求加入 2 ×Tricine 蛋白加样缓冲液（见附录） ，按样品 ：缓冲液 =1： 1（v/v）添 加。
> 电泳
将凝胶上样孔朝上固定在蛋白电泳槽内 ，分别在内外槽加入电泳缓冲液（外槽至少没过 电极或铂
丝 ， 内槽加满/没过上样孔）；
轻轻地垂直用力拔出凝胶中的梳子 ，上样前可先用移液器吸取电泳缓冲液后吹吸上样孔
, 除去加
样孔的残胶；
用微量移液器上样并记录样品顺序；
将电压调至恒压 150V ，起始电流 45-55 mA ，结束电流 10-15 mA ， 电泳 2~3h；
观察到前端的溴酚
蓝指示带至分离胶下沿位置即可停止电泳。
*如有条件 ，可使用专用的凝胶上样吸头或微型注射器将样品完整的加入孔中。上样量不要 过度。如 果样品溢入相邻的加样孔中 ，会影响实验结果。在样品孔中注入样品时 ，注意不 要接触到孔的底部 ， 否则会产生扭曲的条带； 吸头也不宜过高 ，避免样品在缓冲液中弥散 。上样操作时间也不易过长 ，先
点入的样品在缓冲液中浸泡太久易弥散。
> 染色
使用摇匀的SmartBuffers®一步法快速蛋白染色液(Cat No.: FSB-1000) ，将电泳完的 PAGE 胶取出放入塑料容器，
加入染色液 ， 刚好浸没胶面 ，静置 1~2min。随后常温摇床 10~15min ，观察结果。 附录 聚丙烯酰胺凝胶电泳相关溶液的配制
10%过硫酸铵（APS） > 配制方法（ 10mL）：
称取 1g 过硫酸铵至 1.5mL 离心管中，加入 10mL 双蒸水，振荡溶解后按 1mL 每管分 装于 1.5mL 离心管中然后冻存于-20℃。
*固体过硫酸铵放置时间过长会潮解失效 ，最好购买过硫酸铵小包装或购买后分装使用 ，密 封储存与干燥 处或-20℃冻存。过硫酸铵小包装可以一次性配制 ，然后分装 1mL 每管于 1.5mL 离心管然后冻存于-20℃。
40%PAA 分离胶缓冲液(19:1)
用量 | |
丙稀酰胺 | 38g |
甲叉双丙稀酰胺 | 2g |
ddH2O | 定容至 100mL |
配制后 4℃避光储存。 | |
40%PAA 浓缩胶缓冲液(29:1) 用量 丙稀酰胺 38.67g | |
甲叉双丙稀酰胺 | 1.33g |
ddH2O | 定容至 100mL |
配制后 4℃避光储存
用量 | |
Tris | 182g |
SDS | 2.0g（ 20mL 10%SDS） |
盐酸 | 1mol/L 调节 pH8.45 |
ddH2O | 定容至 500mL |
配制后 4℃储存
在分离胶中使用 SDS 的缺点之一系统是多余的 SDS 作为一个大前沿在分离的低分子量末端。较小多 肽 不会从这个前沿分离。更换 Laemmli 运行缓冲液中的甘氨酸为 Tricine ，可将 SDS-多肽与 SDS 带分开 , 使它形成在前导离子前沿的后面。蛋白质在 Tricine 凝胶中的分辨率小至 1 –5k D。
10×Tricine-Tris-SDS 缓冲液配制（ 500mL）：
将 10 ×Tricine-Tris-SDS 缓冲液按照下表配方配制 ，即配成 500mL 10×TTS 缓冲液 ，4℃储存 ，取 50mL 10 ×Tricine-Tris-SDS 缓冲液加入 450mL 超纯水 ，即配制成 1 ×TTS 缓冲液用于电泳。
> 10 ×Tricine-Tris-SDS 缓冲液配方（ 1000 mL） : | |
用量 | |
Tris | 121.14g |
Tricine | 179.2g |
SDS | 10g |
ddH2O | 定容至 1000mL |
1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8）蛋白样品缓冲液（ 100mL）
称取 12.11gTris 粉末，到入 100mL 烧杯中，加入 80mL 蒸馏水，搅拌至完全溶解，用 1mol/L 盐酸调至 pH6.8 ，倒入 100mL 容量瓶中 ，用蒸馏水定容至 100mL ，4℃贮存。
2 ×Tricine 蛋白样品加样缓冲液（ 10 mL） | ||
终浓度 | 用量 | |
Tris-HCl（ 1M pH 6.8） | 100mM | 1mL |
Glycerol | 24% | 2.4mL |
SDS | 8% | 0.8g |
DTT | 0.2M | 0.31g |
考马斯亮蓝 G-250 | 0.02% | 2mg |
ddH2O | 定容至 10mL | |
染色液
用量 | |
冰醋酸 | 100 mL |
甲醇 | 450 mL |
考马斯亮蓝 G-250 | 0.25 g |
ddH2O | 定容至 500mL |
脱色液
用量 | |
冰醋酸 ddH2O | 100 mL 定容至 1000 mL |
参考文献 | ||
1 、Schägger, H. Tricine –SDS-PAGE. Nat Protoc 1, 16 | –22 (2006) | |
2 、曹佐武. 有效分离 1kDa 小肽的 Tricine-SDS-PAGE | 方法[J]. | |
中国生物工程杂志, | ||
2004, 24(1): 74-76 | ||
www.GeneBrick.com
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